Konfokalmikroskop

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Beschafft werden soll ein konfokales Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskop des Typs Leica STELLARIS mit integriertem FLIM-Modul FALCON einschließlich der erforderlichen Hard- und Softwarekomponenten. 2. Forschungsbedingte Anforderungen Im Rahmen des Projektes sollen dynamische Veränderungen des sekundären Botenstoffes cAMP in lebenden Zellen gleichzeitig an verschiedenen subzellulären Kompartimenten (Plasmamembran, Endosomen, Golgi-Apparat, endoplasmatisches Retikulum und Zellkern) mittels FLIM-FRET-Biosensoren untersucht werden. Hieraus ergeben sich folgende zwingende technische Anforderungen: - hochauflösende Fluoreszenz-Lebenszeitmessungen (FLIM) für den Einsatz in lebenden Zellen, - sehr hohe Messgeschwindigkeit bei gleichzeitig hoher Photonenausbeute zur Erfassung dynamischer biologischer Prozesse im Sekundenbereich, - äußerst hohe Sensitivität zur Detektion geringer Signale in kleinen subzellulären Kompartimenten bei minimaler Phototoxizität, - flexible und verlustarme Anregungs- und Detektionsmöglichkeiten über ein breites Spektrum zur optimalen Anpassung an unterschiedliche Fluorophore, - Eignung für simultane Multiplexanwendungen mit mehreren Biosensoren, - vollständig integrierte Hard- und Softwarelösung ohne externe Zusatzmodule zur Durchführung komplexer FLIM-FRET-Messungen, - simultane Erfassung von Fluoreszenzlebensdauer und Intensität in mehreren spektralen Kanälen innerhalb eines konfokalen Scans, - Möglichkeit der unmittelbaren, integrierten Live-Datenanalyse lebensdauerbasierter Signale während der Messung. Zwingend erforderliche Anforderungen: Hierzu zählen insbesondere hochauflösende Fluoreszenzlebensdauer-Messungen (FLIM), eine hohe Messgeschwindigkeit bei gleichzeitig hoher Photonenausbeute sowie die Möglichkeit einer unmittelbaren Live-Datenanalyse zur Bewertung lebensdauerbasierter Signale während der Aufnahme. Darüber hinaus ist eine maximale Sensitivität erforderlich, um auch geringe Signaländerungen in kleinen subzellulären Kompartimenten zuverlässig detektieren zu können. Zudem ist eine flexible Anregung unterschiedlicher Fluorophore im Sinne von Multiplexing-Ansätzen notwendig. Weiterhin ist eine vollständig integrierte Hard- und Softwarelösung erforderlich, um eine reproduzierbare und anwenderfreundliche Durchführung komplexer FLIM-FRET-Experimente sicherzustellen. Diese Anforderungen sind für die Leistungserbringung zwingend erforderlich. Vollständig integriertes FLIM-Modul: Ein wesentliches Kriterium stellt die Verfügbarkeit eines vollständig integrierten FLIM-(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)-Moduls dar, das für die Leistungserbringung zwingend erforderlich ist. Das System Leica STELLARIS FALCON verfügt über ein vollständig integriertes FLIM-Modul, welches schnelle FLIM-Messungen innerhalb einer einheitlichen Systemarchitektur erlaubt. Im Gegensatz zu klassischem TCSPC ermöglicht die verwendete Detektionstechnologie eine deutlich erhöhte Messgeschwindigkeit bei gleichzeitig hoher Photonenausbeute. Die Systemtotzeit beträgt etwa 1,5 ns, wodurch Zählraten von bis zu 80 Mcps bei einer Laser-Pulswiederholfrequenz von 80 MHz erreicht werden können. Dies erlaubt eine wesentlich effizientere Nutzung der emittierten Photonen im Vergleich zu konventionellen TCSPC-basierten Systemen, bei denen aufgrund längerer Totzeiten ein signifikanter Anteil der Photonen nicht detektiert werden kann. Die integrierte Systemlösung ermöglicht außerdem die Verwendung identischer Laserquellen und Detektoren für sowohl konfokale Bildgebung als auch FLIM-Messungen. Sie gewährt so eine konsistente optische Konfiguration ohne Systemwechsel. Zudem ermöglicht das System die simultane Erfassung von Fluoreszenzlebensdauer und Fluoreszenzintensität in mehreren spektralen Kanälen innerhalb eines konfokalen Scans, was insbesondere für dynamische und multiparametrische Experimente von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz dazu bieten die Systeme Zeiss LSM 980 Airyscan 2, Nikon AXR und Evident FV4000 kein integriertes FLIM und erfordern die zusätzliche Implementierung externer Komponenten (z. B. von PicoQuant oder Becker & Hickl). Eine vollständige Integration in die bestehende konfokale Software- und Hardwareumgebung ist dabei nicht gegeben. Stattdessen basiert die Umsetzung auf einer Kopplung mehrerer Komponenten, einschließlich externer Laserquellen, Detektoren und separater Auswertesoftware. Dies führt zu einer erhöhten Komplexität im experimentellen Workflow, da Steuerung, Datenerfassung und Analyse nicht innerhalb einer einheitlichen Benutzeroberfläche erfolgen, sowie einer starken Einschränkung des so realisierbaren experimentellen Workflows. Eine durchgängig konsistente und vollständig integrierte Bedienung, wie sie bei einem integrierten System vorliegt, ist somit nur eingeschränkt realisierbar. Dieses Kriterium ist für die Leistungserbringung jedoch zwingend erforderlich.

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